Szybka metoda oznaczania Salmonelli metodą PCR – wady i zalety

Produkty, w których wykrywane są pałeczki Salmonella to głównie: jaja, produkty mleczarskie, wyroby ciastkarskie, nabiałowe, rośliny oleiste, pasze, ale przede wszystkim mięso – 65% przypadków to drób. Do zakażenia produktów żywnościowych bakteriami z rodzaju Salmonella może dojść na każdym etapie produkcji, począwszy od wstępnej obróbki aż po pakowanie i transport. Badaniom mikrobiologicznym poddawane są surowce, półprodukty oraz oczywiście produkt końcowy. Konieczne są także badania personelu oraz środowiska produkcyjnego.

Znanych jest ponad 2000 serotypów Salmonella, z których wszystkie są potencjalnie chorobotwórcze dla człowieka. Zapewnienie jakości i bezpieczeństwa żywności to najistotniejsze kryterium dla zdrowia i życia ludzi, a także  zwierząt. Aby chronić zdrowie konsumentów potrzeba szybkiej, dokładnej oraz skutecznej diagnostyki.

Konwencjonalna metoda wykrywania bakterii Salmonella wg normy PN-EN ISO 6579-1:2017-04, jest powszechnie stosowana w laboratoriach. Analiza ta jest pracochłonna oraz czasochłonna, może trwać od 3 do około 7 dni w przypadku wyniku pozytywnego. Metoda ta polega na wykonywaniu szeregu przesiewów i hodowli na różnych pożywkach, wymaga najróżniejszych etapów identyfikacji – od morfologicznych, przez biochemiczne, aż po serologiczne. Gdzie dość często interpretacja tych testów jest trudna. W związku z tym, metody tradycyjne są stopniowo wypierane przez metody alternatywne, pozwalające na szybkie wykrycie bakterii patogennych. Obiecujące są tutaj metody oparte na technice PCR. Do najnowocześniejszych analiz opartych na tej technice, należą analizy z zastosowaniem reakcji Real-Time PCR.

Rozporządzenie Komisji (WE) 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. w sprawie kryteriów mikrobiologicznych dotyczących środków spożywczych (z późniejszymi zmianami), dopuszcza możliwość wykorzystywania metod alternatywnych przez laboratoria oraz sektor przemysłu spożywczego. Szczególnie chodzi tutaj o tzw. metody szybkie, w tym metodę Real-Time PCR. Niemniej jednak, metody te, muszą być potwierdzone procedurą walidacyjną i dawać równoważne wyniki z metodą referencyjną. 

Na czym polega metoda Real-time PCR?

Metoda Real-time PCR umożliwia pomiar nowych kopii produktu reakcji w czasie rzeczywistym. Jest to technika bardzo czuła, pozwala na wykrycie swoistych sekwencji DNA unikalnych dla Salmonella spp. w badanej próbce. Wykazano, iż metoda ta umożliwia wykrycie nawet niewielkiej ilości bakterii Salmonella. Na rynku istnieje ogromny wybór gotowych testów jakościowych, dzięki którym można oznaczyć jednocześnie do 94 próbek w cyklu trwającym około 2h. Podczas każdego cyklu PCR, na etapie przyłączania starterów, moduł optyczny lub detektor mierzy poziom fluorescencji, natomiast odpowiedni program komputerowy tworzy wykres, na którym widnieje natężenie fluorescencji w stosunku do liczby cykli. PCR w czasie rzeczywistym umożliwia obserwację przebiegu reakcji w trakcie analizy. Metoda pozwala w prosty sposób zinterpretować wynik oraz przebieg analizy.

Zalety i wady techniki Real-time PCR

Technika Real-time PCR niewątpliwie ma więcej plusów niż minusów. Jej główną przewagą jest krótki czas oczekiwania na otrzymanie wyniku. Całkowity czas analizy wraz z etapami naważenia, namnożenia i ekstrakcji DNA mieści się w 24h. Zatem Klient otrzymuje wyniki negatywne po dobie od dostarczenia próbek do laboratorium. Poprzez znaczne skrócenie czasu analizy, ponoszone są, niższe koszty magazynowania produktów dzięki ich szybszemu zwolnieniu, a co za tym idzie? produkty mają dłuższy termin przydatności do spożycia ze względu na wcześniejsze dostarczenie ich na rynek. Otrzymany wynik w tak krótkim czasie, pozwala również, na dużo szybszą reakcję w przypadku wykrytego skażenia i podjęciu stosownych kroków.

Kolejnym plusem jest mniej skomplikowana procedura postępowania. Najistotniejszym etapem jest etap przedanalityczny, czyli m.in. zachowanie warunków czasowych oraz temperaturowych. Doświadczony analityk nie będzie miał większych trudności podczas ekstrakcji DNA, a co za tym idzie ryzyko kontaminacji próbek jest znikome. Dodatkowo, dzięki temu, że pomiar i odczyt zachodzi w termocyklerze możliwość zafałszowania wyniku jest również mało prawdopodobna.

Produkty najbardziej narażone na przenoszenie pałeczek Salmonella tj. mięso, jaja nie są problematycznymi matrycami w metodzie Real-time PCR. Rzadko powodują inhibicję, wyniki są jednoznaczne co powinno skłonić producentów żywności do większej ufności ku omawianej  metodzie, która jest niewątpliwie precyzyjna i powtarzalna.

Technika PCR w porównaniu do innych metod konwencjonalnych, wyróżnia się dużą prostotą, specyficznością, a także, ma bardzo wysoką czułość, co umożliwia wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA. Jest skuteczną metodą do identyfikacji bakterii z różnych matryc żywnościowych. Metoda Real-Time PCR pozwala również na uzyskanie graficznych wykresów, łatwych w interpretacji wyników. W przypadku klasycznej metody, zgodnej z normą PN-EN ISO 6579-1:2017-04, otrzymany wynik, obarczony jest subiektywną oceną analityka, a także zmiennością cech fizjologicznych ocenianych w testach biochemicznych.

Możliwymi ograniczeniami w stosowaniu metod opartych na technice PCR, jest wykrywanie wszystkich obecnych cząsteczek DNA, bez różnicowania żywych i martwych komórek. Wykrycie martwych komórek bakterii Salmonella, nie odgrywają ważnej roli, a jedynie mogą świadczyć o skuteczności środków dezynfekcji. Dlatego należy podkreślić, iż wyniki pozytywne uzyskane metodą PCR należy potwierdzić metodą klasyczną na normę PN-EN ISO 6579-1:2017-04 lub bezpośrednio na płytkach chromogennych. Sposób potwierdzeń wyników dodatnich, zależy od metody przyjętej przez laboratorium.    

Innym poważnym problem jest obecność inhibitorów reakcji PCR w próbkach żywności. W związku z tym można dokonywać pewnych modyfikacji, ułatwiających reakcję  PCR, aby nie zaszła inhibicja. Obecnie istnieje wiele metod przygotowywania próbek, mających na celu usunięcie inhibitorów, można tutaj wymienić między innymi: odwirowanie, rozcieńczenie próbek, stosowanie rozpuszczalników organicznych. Więc nie jest to problem bez rozwiązania i dzięki zastosowaniu powyższych kroków reakcja powinna przebiec prawidłowo. 

Szybkie metody identyfikacji patogenów w żywności, oparte na analizie struktury DNA, należą do jednych z najważniejszych rozwiązań technicznych w mikrobiologii molekularnej. Obecnie jest to jedna z najbardziej obiecujących metod w szybkim wykrywaniu drobnoustrojów patogennych w żywności.

Marzena Pura, Małgorzata Deptuła, ekspertki SGS Polska z branży Health & Nutrition